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　　魚腫瘤壞死因子a(TNF-a)ELISA檢測試劑盒使用說明書

　　BS-3794魚腫瘤壞死因子a(TNF-a)ELISA試劑盒

　　一、實驗原理

　　本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測魚血清、血漿或組織勻漿中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。實驗通過以下步驟實現(xiàn)：

　　將純化的魚TNF-α抗體包被于微孔板形成固相抗體

　　加入樣本后，樣本中的TNF-α與固相抗體結(jié)合

　　加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，形成"抗體-抗原-酶標(biāo)抗體"復(fù)合物

　　經(jīng)洗滌后加入底物TMB顯色

　　顯色深淺與樣本中TNF-α濃度呈正相關(guān)，通過酶標(biāo)儀測定吸光度計算含量

　　二、試劑盒組成

　　96孔/48孔酶標(biāo)板(預(yù)包被抗體)

　　標(biāo)準(zhǔn)品(凍干粉，需復(fù)溶)

　　標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

　　樣本稀釋液

　　HRP標(biāo)記檢測抗體

　　顯色底物A液(TMB)

　　顯色底物B液

　　終止液

　　濃縮洗滌液(20-30倍濃縮)

　　封板膜

　　說明書

　　三、自備器材

　　酶標(biāo)儀(450nm波長)

　　精密移液器及槍頭(0.5-10μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL)

　　37℃恒溫箱

　　洗板機(jī)(或手動洗板裝置)

　　去離子水

　　離心機(jī)(2000-3000rpm)

　　四、樣本處理

　　血清樣本

　　室溫血液自然凝固10-20分鐘

　　2000-3000rpm離心20分鐘

　　立即分離血清，避免溶血

　　分裝保存：-20℃(避免反復(fù)凍融)

　　血漿樣本

　　使用EDTA/肝素抗凝

　　3000rpm離心30分鐘

　　立即分離血漿

　　分裝保存：-20℃(避免反復(fù)凍融)

　　組織勻漿

　　組織塊加入生理鹽水搗碎

　　3000rpm離心10分鐘

　　取上清液檢測

　　五、操作步驟

　　試劑準(zhǔn)備?：

　　標(biāo)準(zhǔn)品：凍干粉加1mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶，靜置10分鐘后混勻，按說明書進(jìn)行倍比稀釋

　　洗滌液：濃縮液用去離子水稀釋(20-30倍)，室溫使用

　　加樣?：

　　設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔

　　每孔加100μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本

　　37℃孵育90分鐘

　　洗板?：

　　甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液

　　靜置1分鐘后甩去，重復(fù)5次

　　吸水紙上拍干

　　加酶標(biāo)抗體?：

　　每孔加100μL HRP標(biāo)記抗體(空白孔除外)

　　37℃孵育60分鐘

　　顯色?：

　　每孔加底物A、B各50μL

　　37℃避光孵育15分鐘

　　終止反應(yīng)?：

　　每孔加終止液50μL

　　15分鐘內(nèi)測定OD值

　　六、注意事項

　　試劑保存?：

　　2-8℃保存，有效期6個月

　　使用前室溫平衡20分鐘

　　濃縮洗滌液結(jié)晶時，37℃水浴溶解

　　操作規(guī)范?：

　　不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品/樣本使用新槍頭

　　加樣順序保持一致保證孵育時間相同

　　顯色底物避光保存，變藍(lán)即失效

　　終止液加入順序與底物一致

　　質(zhì)量控制?：

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線R值應(yīng)≥0.95

　　批內(nèi)CV<10%，批間CV<15%

　　靈敏度通常<1.0ng/mL

　　七、結(jié)果計算

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　樣本OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度

　　樣本稀釋倍數(shù)需在最終結(jié)果中乘以相應(yīng)系數(shù)

　　八、性能指標(biāo)

　　檢測范圍：3-80ng/mL(具體以實際試劑盒為準(zhǔn))

　　特異性：不與其他細(xì)胞因子交叉反應(yīng)

　　重復(fù)性：板內(nèi)/板間變異系數(shù)符合要求

　　九、安全提示

　　終止液含硫酸，操作時注意防護(hù)

　　所有廢棄物按生物危害物處理

　　實驗過程避免交叉污染

　　注：以上僅供參考，本產(chǎn)品僅供科研使用，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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